评价结论：为评估“脂来安”对猪流行性腹泻病毒（PEDV）的体内抗病毒效果，本实验设计了仔猪感染PEDV后的抗病毒治疗研究，通过体内实验评估脂来安对PEDV的抗病毒效果。实验分为五组：A1组、A2组、A3组为治疗组，分别在攻毒同时、攻毒后第二天、攻毒前两天进行脂来安治疗；B组为空白对照组，C组为病毒对照组。在体内抗病毒效果评估中，仔猪分别进行病毒攻毒、临床症状观察、病毒排毒、病毒血症、组织病毒载量和死亡率等指标的监测。结果表明，脂来安在PEDV感染后的治疗效果显著，其中提前给药（A3组）效果最佳，能够有效减轻仔猪的腹泻、提高存活率、减少病毒载量，并减轻病理损伤；同时给药（A1组）和延迟给药（A2组）也表现出一定的抗病毒作用，但效果相对较弱。尤其是在延迟给药的情况下，部分炎症反应仍然较强，治疗效果较差。对照组（B组）仔猪未出现PEDV症状，而病毒对照组（C组）仔猪的症状持续恶化，最终死亡。综合来看，脂来安在抗PEDV方面表现出了较强的抑制作用，特别是在提前给药的情况下，能够有效减轻临床症状、降低病毒载量并改善病理损伤，具有潜在的临床应用价值。

关键词：脂来安，猪流行性腹泻病毒（PEDV），体内抗病毒效果评价

1脂来安体内抗PEDV效果评价

1.1 实验材料

1.1.1 试剂

PrimeScript™ RT reagent Kit (Perfect Real Time)、DNA/RNA提取试剂盒、TB Green^® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus）购于宝生物（大连）工程有限公司。

1.1.2毒株和实验动物

PEDV SC株由四川农业大学动物生物技术中心提供；20头仔猪及饲料购买于成都旺江农牧科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1仔猪分组及攻毒给药

在实验前对试验场地进行严格地消毒，先用甲醛熏蒸过夜，后用百毒杀喷洒消毒。在购进猪后按照规模化养殖场的条件进行饲养，防止猪群出现应激和细菌感染，随时注意猪的清洁工作，用适合仔猪生长的全价饲料进行饲养。先观察3天，无异常后再进行攻毒与灌服脂来安。20头断奶仔猪分为5组，每组4头，详细分组信息见表1。取20只断奶仔猪，随机平均分成5组，A₁、A₂、A₃为治疗组，B为空白对照组，C为病毒对照组。仔猪分组信息、攻毒和给药时间如下表：

1.2.2临床症状观察

每日观察各组仔猪临床症状并收集粪便检测PEDV。当出现明显的腹泻症状并濒临死亡时立即处死并剖解，采集小肠。连续观察7d。

攻毒7d后，剖杀全部猪只解剖。采集肠道组织及肠系膜淋巴结冻存并固定于4%多聚甲醛。

1.2.3 RT-qPCR定量检测组织PEDV载量

将收集到的肠道组织、肠系膜淋巴结及粪便，研磨后，使用3.0mL PBS充分混匀，置于离心机12000r/min，离心3min。取上清液，参考RNAiso说明书，抽提RNA。将得到的RNA进行反转录得到cDNA。荧光定量引物PEDV F:AAATGGGAAGTCGGCAGA；PEDV R:GTTTTGTTGTGGCGGTAG。cDNA通过荧光定量PCR，检测PEDV病毒载量，反应体系如表2；反应程序：95℃预变性30s；95℃5s；60℃30s；进行40个循环。溶解曲线：95℃，65℃以每秒升高0.5℃至95℃。

1.2.4 仔猪病理组织学观察

4%多聚甲醛固定的肠道组织，经过脱水、透化、包埋、切片、脱蜡、复水、染色、封片等步骤，制作HE染色切片，在显微镜下观察肠道病理变化。

1.2.5 细胞因子测定

在攻毒后第0天以及第3天采集仔猪静脉血，使用试剂盒检测仔猪血液中IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、IFN-γ、TNF-α等细胞因子水平。

1.3 实验结果

1.3.1 攻毒后各组仔猪死亡情况

  在攻毒和给药后，连续观察7天，结果显示（表3）：A组中，A2组在第6天有1头猪死亡，之后没有仔猪死亡。B组没有仔猪死亡。C组在第4天死亡一头。

1.3.2 攻毒后各组仔猪临床症状观察

  如表4所示，在攻毒后，A组和C组仔猪均表现出腹泻、厌食及精神萎靡等临床症状，但随病程发展，两组病情出现明显差异。A组仔猪腹泻症状逐渐减轻，精神状态和采食量稳步恢复，其中A1组和A3组恢复情况相似，A2组恢复相对较慢。C组病情持续恶化。B组仔猪未出现明显异常，始终保持良好状态。

1.3.3 脂来安对仔猪攻毒后排毒的影响

每日采集肛门粪便样本并测定PEDV CT值。结果显示（附加表1和图1）：A1组和A3组CT值在第1天达到最低点，随后持续上升；A2组在给药后CT值开始升高，表明脂来安对PEDV增殖具有抑制作用。B组未检测到PEDV。C组CT值持续下降，表明病毒载量随时间不断上升，在死亡时达到最高值。

1.3.4 脂来安对仔猪攻毒后各组织病毒载量的影响

剖杀濒死的仔猪及7天后存活的仔猪，取出肠道组织和肠系膜淋巴结，通过荧光定量PCR方法检测组织中的病毒载量。结果如附加表2和图2所示：A组的两个组织中病毒载量均显著低于C组，且肠系膜淋巴结和肠道的病毒载量大致相当。而在C组中，肠系膜淋巴结的病毒载量明显高于肠道组织。结果表明，脂来安能够有效降低肠道及肠系膜淋巴结中的病毒载量。

1.3.5 仔猪剖检及病理观察

C组（攻毒对照组）仔猪在接种病毒48小时内均出现典型的流行性腹泻临床症状，包括身体消瘦、精神萎靡、食欲下降、被毛粗乱，并排出黄色水样粪便，伴有恶臭味（图3a、b、c）。部分仔猪因严重腹泻脱水，无法站立。攻毒后第3天开始有仔猪死亡，死亡1头。剖检结果显示：肠腔内充满黄色内容物和气体，肠壁变薄，呈半透明状，缺乏弹性，肠系膜淋巴结明显肿大，符合PEDV的典型病理变化。其他器官未见明显异常。7天后，C组无仔猪存活。

A组（脂来安组）的临床症状较C组逐渐减轻。其中，A1组和A3组发生腹泻，但无仔猪死亡，剖检症状与C组相似。A2组在第6天有1头仔猪死亡，其余仔猪均存活至7天。B组未见明显异常（图3d）。

病理切片观察显示：C组仔猪肠道肠绒毛断裂或萎缩变短（图4a），绒毛间隙增大，部分区域出现破损，上皮细胞坏死脱落，伴有炎性细胞浸润（图4b、c）。A组肠道肠绒毛有轻微破损，出现融合现象，并伴有炎性细胞浸润（图4d、e）。B组肠道病理切片显示小肠组织形态正常，肠绒毛排列整齐，绒毛和杯状细胞结构清晰可见（图4f）。

1.3.6 细胞因子测定结果

根据各组仔猪细胞因子测定结果（附加表3和图5）可见，在病毒对照组（C）中，几乎所有促炎因子（IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ、IL-1β）在3d均大幅上升，表现出典型的炎症风暴特征，同时IL-10也有所上升，提示机体启动抗炎调节机制。

在治疗组中，A1（同时给药）和A3（提前给药）能明显抑制炎症因子的过度升高，表现为TNF-α、IL-8等虽有增加，但上升幅度低于病毒对照组，尤其是A3，在炎症因子整体水平上更接近于可控状态，提示其在预防炎症反应上作用最佳。相比之下，A2（延迟给药）虽然大部分因子也有一定缓解，但IL-1β却异常升高，说明在炎症已被触发后再进行干预，药物效果有限，甚至可能放大炎症反应。

在空白对照组（B） 中，细胞因子水平保持稳定，仅有轻微波动，验证了基础水平的可靠性。

总体而言，病毒感染会诱导强烈的促炎因子风暴，而药物干预能在不同程度上缓解炎症，结合临床症状、组织切片和细胞因子水平分析，预防性给药（A3）效果最佳，同时给药（A1）次之，而延迟给药（A2）效果不明显。与此同时，IL-10的普遍升高说明机体在炎症过程中始终伴随负反馈调控，力图维持免疫平衡。