“脂来安”对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)的

体内抗病毒效果评价报告

四川农业大学 徐志文教授团队

评价结论：本实验旨在评估脂来安对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的体内抗病毒效果。实验通过设置多个组别（脂来安组、空白对照组、病毒对照组及油对照组）对24头仔猪进行攻毒，并根据不同的治疗时机及剂量进行口服给药。结果表明，脂来安在预防PRRSV感染及减轻病毒负担方面表现出显著效果。在临床症状方面，脂来安组的仔猪表现出较轻的发病症状，发病时间较晚，且症状较轻。特别是A2组（高剂量脂来安组），症状恢复速度较快，无仔猪死亡。相较之下，病毒对照组（C组）仔猪症状严重，且死亡率较高。此外，脂来安能够显著减少病毒的排毒，A组的排毒高峰值明显低于C组，并且排毒持续时间较短。病毒载量检测结果显示，脂来安能够有效抑制PRRSV在仔猪体内的复制，特别是在肺脏和肺门淋巴结中，病毒载量明显低于病毒对照组，而油对照组的效果则较为有限。病理观察证实，脂来安组仔猪的肺组织损伤轻于病毒对照组，表现出较少的炎性细胞浸润和肺泡损伤。细胞因子分析结果表明，脂来安对炎症反应有一定抑制作用，尤其在减少促炎因子（如IL-6、TNF-a、IL-1B）的升高方面具有显著效果。同时，脂来安在高剂量下能够增强细胞免疫反应，促进IFN-Y的升高。综上所述，脂来安对PRRSV感染具有明显的抗病毒效果，能够有效减轻临床症状、降低病毒载量并调节免疫反应，特别是在高剂量使用时，表现出更好的抗病毒作用和免疫调节效果。

关键词：脂来安，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），体内抗病毒效果评价

1.脂来安体内抗PRRSV效果评价

1.1实验材料

1.1.1实验试剂

PrimeScript™RT reagent Kit(Perfect Real Time)、DNA/RNA提取试剂盒、TBGreenRPremix ExTaq™(Tli RNaseH Plus)购于宝生物（大连）工程有限公司。

1.1.2毒株和实验动物

PRRSV NJ毒株由四川农业大学动物生物技术中心提供；24头仔猪及饲料购自成都旺江农牧科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1仔猪分组及攻毒给药

在实验前对试验场地进行严格的消毒，先用甲醛熏蒸过夜，后用百毒杀喷酒消毒。在购进猪后按照规模化养殖场的条件进行饲养，防止猪群出现应激和细菌感染，随时注意的猪的清洁工作，用适合仔猪生长的全价饲料进行饲养。先观察3天，无异常后再进行攻毒与灌服药物。24头断奶仔猪分为6组，每组4头，详细分组信息见1，A1、A2组为脂来安试验组，B组为空白对照组，C组为病毒对照，D1、D2为油对照组。仔猪分组信息、攻毒和给药时间如下表：

1.2.2临床症状观察

每日观察各组仔猪临床症状并收集鼻拭子检测PRRSV。同时每日测定体温及采血。当出现明显的喘气症状并濒临死亡时立即处死并剖解，采集肺脏及肺门淋巴结。连续观察14d。

攻毒14d后，剖杀全部猪只。采集肺脏组织及肺门淋巴结冻存并固定于4%多聚甲醛。

1.2.3 RT-qPCR定量检测组织PRRSV载量

将收集到的肺脏、肺门淋巴结研磨后，使用3.0mLPBS充分混匀，置于离心机1200Or/min，离心3min。取上清液，参考RNAiso说明书，抽提RNA。将得到的RNA进行反转录得到cDNA。cDNA通过荧光定量PCR，检测PRRSV病毒载量，反应体系如表6；反应程序：95℃预变性30s；95℃5s；60℃30s；进行40个循环。溶解曲线：95℃，65℃以每秒升高0.5℃至95℃。

1.2.4仔猪病理组织学观察

4%多聚甲醛固定的肺脏及肺门淋巴结，经过脱水、透化、包埋、切片、脱蜡、复水、染色、封片等步骤，制作HE染色切片，在显微镜下观察病理变化。

1.2.5 细胞因子测定

在攻毒后第0天以及第3天采集仔猪静脉血，使用试剂盒检测仔猪血液中IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、IFN-Y、TNF-a等细胞因子水平。

1.3实验结果

1.3.1各组仔猪死亡情况

在攻毒给药后连续观察14d，结果显示（表3）：A组中，A1组第9天有1头仔猪死亡，A2组无死亡；B组在观察期间无仔猪死亡；C组第5、9、10、13天分别死亡1头，共死亡4头；D1组在第1、13天各死亡1头，D2组在第8、13天各死亡1头，共死亡2头。此外，A、B、D各组剩余仔猪在第14天全部剖杀，C组无剩余仔猪剖杀。

1.3.2攻毒后各组仔猪临床症状观察

在攻毒后，各组仔猪均出现了发热、喷嚏、呼吸困难、神经症状和采食量下降等临床症状，但不同组之间的发病先后、严重程度及症状表现有所差异（如表4所示）。A组（脂来安实验组）：发热、呼吸道症状和采食下降的临床症状明显，但总体表现较轻，发病时间较晚，症状数量较少，其中A2较A1恢复更快且无死猪。与C组相比，A组的采食量始终较高，且发热症状较轻，呼吸道症状的发生频率较低。B组：在观察期内未出现任何临床症状。C组：发热、呼吸道症状和采食下降症状较为严重，且发病时间较早，症状数量较多，频繁死猪。D组：临床症状逐渐表现，但发病时间较晚，症状的严重程度介于A组与C组之间，且D1和D2都出现了2头死猪。

1.3.3试验期间仔猪体温变化情况

攻毒后各组仔猪体温变化情况如附加表1及图1所示。病毒对照C组仔猪在攻毒后第2天体温即升高，达到39.260℃，第3天迅速升高至40.810℃，并一直维持在高热状态（最高达41.183C）。A组（A1与A2）亦于攻毒后第3天体温显著上升，A1亚组自38.423C升至40.060°℃，第4-6天持续升高至峰值41.160°C，第7天开始明显下降，第8天趋于正常；A2亚组体温变化与A1类似，第3天升至40.187℃，并在第4-6天波动于40.1～40.5℃之间，第8天后逐步恢复正常。对照B组体温变化幅度较小，始终维持在38.1～39.3℃之间，未出现明显高热反应。D组（D1与D2）则在第3天即出现体温升高现象，D1最高升至41.120℃，D2亦超过40℃，体温峰值出现略早于A组，且体温恢复较慢，至第9-10天基本回归正常范围。

图1 各组体温变化

1.3.4试验期间仔猪排毒变化情况

滴鼻攻毒后各组仔猪PRRSV排毒量的变化如附加表2及图2所示。病毒对照C组于第7日至第12天之间维持较高排毒水平，并在第12天达到峰值（TCID₅₀为5.56），排毒持续至第14天才逐步下降，至第11天仍保持较强病毒排出，显示出持续而明显的排毒过程。A组（A1与A2）排毒趋势相对温和，尽管两组均在第6天左右达到排毒高峰（A1峰值为4.78，A2峰值为4.03），但整体峰值低于C组，且排毒下降速度较快。从第10天起，A1与A2的TCID₅₀值显著下降，第13天已接近或低于1.0，第14天时A2已检测不到病毒，A1亦仅为0.54，提示10天后基本不再排毒。空白对照B组在整个实验期间未检测到排毒现象，TCID₅₀始终为0，显示其未发生感染。D组（D1与D2）排毒情况与C组较为接近，排毒峰值分别在第8至第9天达到5.18（D1）和4.97（D2），虽略低于C组，但高于A组；排毒持续时间亦较长，至第14天时仍有一定病毒排出（D1为2.31，D2为2.01）。

图2 攻毒后各仔猪排毒情况

1.3.5攻毒后肺脏、肺门淋巴结病毒载量

攻毒并给药后，对濒死仔猪进行剖检，采集肺脏与肺门淋巴结样本，通过荧光定量PCR检测PRRSV组织载量，结果如附加表3及图3所示。病毒对照C组病毒载量显著高于其他各组，其肺脏中PRRSV拷贝数达31427.1copies/g，肺门淋巴结中更高，达到68776.5copies/g，显示出病毒在呼吸系统组织中的广泛复制，病理状态较为严重。相比之下，A组（A1与A2）组织载量明显较低。A1组肺脏与肺门淋巴结中病毒载量分别为5145.3和15512.3copies/g，A2组略低，分别为4813.5和14547.3copies/g，两者差异不显著，提示脂来安具有良好的病毒抑制作用，且在不同个体间具有较稳定的效果。空白对照B组未检测到病毒（0.0copies/g），进一步验证其未被感染，作为对照组显示良好的对比基准。D组（D1与D2)病毒载量介于A组与C组之间，肺脏载量分别为6964.5和6612.1copies/g，肺门淋巴结为18363.8和17485.8copies/g，说明其对病毒复制具有一定抑制能力，但效果不及A组明显。

1.3.6仔猪剖检及病理观察

通过剖检观察可见（图4），病毒对照C组仔猪肺部病变最为严重（图4a），表现为广泛的肺组织充血、出血、水肿及间质增宽，同时伴有大量炎性细胞浸润、肺泡上皮细胞脱落与坏死等典型PRRSV感染特征，提示病毒在体内高度复制并引发显著组织损伤。A组与D组肺脏亦观察到一定程度的水肿与间质增宽（图4b、c），局部区域可见轻度充血和出血，但总体病变明显轻于C组。B组仔猪肺组织结构完整，无明显病理改变（图4d），与其未检测到病毒排毒和组织病毒载量结果相一致。进一步的组织切片观察结果（图5）显示，C组肺部组织中大量炎性细胞及红细胞渗出（图5a、b），反映出剧烈的免疫反应和组织破坏；而A组与D组组织切片结构均较完整（图5c、d），轻微细胞浸润或出血灶，B组未发生病毒感染（图5e、f）。

图4 仔猪攻毒后肺脏大体病变

A：充血、出血、水肿、间直增宽；B：轻微的充血和间质增宽；C：正常情况

图5 肺脏病理切片观察

A、B：大量炎性细胞和红细胞浸润，间质增厚；C、D：轻微细胞浸润和间质增厚；

E、F：未见明显异常

1.3.7 细胞因子测定结果

如图6所示，第0天各实验组仔猪体内多种细胞因子（IL-8、IFN-Y、IL-6、TNF-α、IL-1B、IL-10）均处于正常基础水平。攻毒后第3天，各实验组（A1、A2、D1、D2）及攻毒对照组C的炎症因子均出现不同程度的升高。在促炎因子方面，C组表现出最强烈的炎症反应，IL-8、IL-6、TNF-a与IL-1B水平均显著升高，尤其IL-6与IL-1β在C组中达到最高值（分别为264.96 pg/mL与439.79pg/mL），说明病毒在未干预条件下诱导了剧烈的炎症风暴。相比之下，A1与A2组各因子升高幅度明显小于C组，其中A1组普遍高于A2，提示脂来安在高、低剂量下对炎症反应具有抑制剂量依赖性。在IFN-Y变化趋势上，各攻毒组均显著升高，其中A2上升幅度最大，说明脂来安能增强细胞免疫反应的激活。在IL-10（抗炎因子）方面，攻毒后所有处理组IL-10水平均有提升，其中D组与C组IL-10达到200～300pg/mL水平，显示炎症后期机体尝试自我调节反应；但A组的IL-10水平上升幅度明显较低，脂来安可能对抗炎平衡作用有一定抑制。空白对照组B在所有细胞因子中均未见明显波动，证明试验的可靠性。

图6 仔猪在PRRSV攻毒并给药当天与PRRSV攻毒并给药后第3天细胞因子水平