脂来安对猪流行性腹泻病毒（PEDV）与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的体外抗病毒效果评价报告

四川农业大学 徐志文教授团队

评价结论：本实验评估了脂来安对猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的体外抗病毒效果。实验通过细胞毒性试验（CCK8法）和病毒抑制效果测试，评估脂来安在不同浓度下对Vero和Marc-145细胞的影响，并分析其对PEDV和PRRSV的抑制作用。在抗PEDV实验中，脂来安在稀释10240倍的浓度下表现出显著的细胞保护作用，显著提高了Vero细胞的存活率。同时，qPCR检测结果表明，脂来安在上述浓度下能够显著降低PEDV的病毒RNA拷贝数，证明其通过抑制PEDV复制发挥抗病毒作用。在抗PRRSV实验中，脂来安在1280至2560倍的浓度范围内表现出一定的直接杀灭作用，能够有效抑制PRRSV的增殖。然而，在这些浓度下，脂来安无法阻止PRRSV感染Marc-145细胞，表明其对PRRSV的抑制作用有限，主要表现在对病毒增殖的抑制，而非阻断病毒初始感染。综上所述，脂来安对PEDV具有较强的抑制作用，特别是在特定浓度下能够显著降低病毒载量并提高细胞存活率。而对于PRRSV，脂来安表现出一定的抑制效果，但无法阻止病毒的初步感染，其抗病毒作用主要体现在抑制病毒增殖阶段。

关键词：脂来安，猪流行性腹泻病毒（PEDV），猪繁殖与呼吸综合征病毒

（PRRSV），体外抗病毒效果评价

1.实验材料

1.1实验细胞、病毒与动物

本实验使用的所有细胞（Vero、Marc-145）、病毒（PRRSV、PEDV)均由四川农业大学动物医学院动物生物技术中心（ABTC）繁殖保存。

1.2实验器材与试剂

胎牛血清、细胞培养液（DMEM培养液）、胰蛋白酶、PBS缓冲液由ABTC提供；DMSO购买自SIGA（USA）；实验所使用的CCK8试剂盒（编号：Beyotime.C0038）购买自碧云天生物技术有限公司；脂来安由新奥公司提供；细胞完全培养基（生长液）为含1O% FBS的DMEM培养基，细胞维持培养基（维持液为（PRRSV：含FBS2%；PEDV不含FBS）的DMEM培养基。

2试验方法

2.1细胞的复苏、培养与单层细胞制备

根据实验需要分别复苏Vero、Marc-145细胞，使用生长液在细胞培养瓶中分别培养Vero细胞（37℃，5% CO₂），传代1至2代后用胰酶消化传代接种至4个96孔板，在37℃，5% CO₂下分别培养24h-36h，直到细胞生长至单层。

2.2半数细胞毒性浓度和最大无毒浓度的测定

取脂来安原液1mL，加入9mL维持液，稀释成10^-1的母液，再使用维持液

进行2倍梯度稀释，共设置11个浓度梯度。将已长成单层细胞的96孔板弃去上清液，加入样品溶液，100微升/孔，每个组合每个浓度4孔重复，设置4个含有1% DMSO的维持液的孔作为对照组A，设置4个仅使用维持液培养的细胞对照组B，置于培养箱，37℃，5% CO₂，培养48h。

按照CCK8试剂盒说明进行细胞毒性检测，计算细胞存活率，并使用GraphPadPrism5计算最大无毒浓度（MNTD）。细胞存活率大于90%时对应的浓度为无毒浓度，选择脂来安的最大无毒浓度（MNTD）进行下一步实验。

2.3体外抗PEDV实验

将Vero细胞分别接种至96孔板上，在37℃，5% CO₂下分别培养长至单层。将冻存的PEDV病毒液置于冰上解冻，使用维持液将病毒液稀释至20O TCID₅₀，同时使用维持液将样液稀释至2 MNTD，将稀释后的病毒液与样液等体积混合，配成终浓度为1MNTD样品溶液与1O0 TCID₅₀的病毒液的混合液，涡旋混匀，注明溶液中的病毒类型编号，置于-20℃储存；使用含2% DMSO的维持液与用维持液稀释至200 TCID₅₀的病毒液等体积混合，涡旋混匀后注明病毒类型，置于-20℃储存；使用维持液分别将母液稀释到MNTD浓度，置于-20℃储存。所有试剂均限当日使用。

设置4个梯度实验组，1个病毒对照组，1个空白对照组，每组设置6个重复。将已长成单层细胞的96孔板弃去上清液，分别向4个实验组加入100微升

(0.1×（1/2）⁹,0.1×（1/2）¹⁰,0.1×（1/2）¹¹,0.1×（1/2）¹²）浓度的样液，向病毒对照组和空白对照组孔中各加入100微升维持液，在37℃，5% CO₂下孵育2h。取出孵育完毕的96孔板，弃去上清液，取配制好的200 TCID₅₀病毒液与（0.2×（1/2）⁹,0.2×（1/2）¹⁰,0.2×（1/2）,0.2×（1/2）¹²）浓度样液的等体积混合液加入各实验组孔，每孔100微升；设置病毒对照组：取100 TCID50的病毒液，加入病毒对照组孔，每孔100微升；设置空白对照组：取维持液（含实验组与病毒组等量接毒胰酶）加入空白对照组孔，每孔100微升37℃，5% CO₂下孵育吸附1h。孵育完成后弃去上清液，分别向实验组孔中加入100微升对应浓度的样品溶液，向病毒对照组和空白对照组孔中各加入100微升维持液，在37℃，5% CO₂下孵育36-72h。36-72h间定时观察各组产生CPE情况，当病毒对照组出现明显细胞病变时停止孵育，收集孔内上清，CCK8法测各孔OD₄₅₀nm值，计算各组细胞活性，并用qPCR检测各组病毒CT值与β-actin CT值，计算相对表达量。

2.4 体外抗PRRSV实验

  采用三种处理方式进行抗病毒实验，分别是共处理、预处理和后处理，具体如图1所示。以下实验均在安全浓度以内完成。

图1三种处理方式

共处理是为了测定药物对病毒的直接杀灭作用，将MARC-145细胞接种于96孔板中，长至80%～90%，弃培养液。用不同稀释倍数的脂来安和100 TCID₅₀的PRRSV混合液共同作用于细胞2h，弃上清，PBS洗2次，加入维持液，设空白对照组和病毒对照组，转入培养箱中37°C培养至72h，观察细胞病变及测定药物处理组和病毒对照组PRRSV载量的变化。

预处理是为了测定药物阻断病毒感染的作用，将MARC-145细胞接种于96孔板，长至80%～90%，PBS洗2次。用不同稀释倍数的脂来安作用于细胞2h，弃上清，PBS洗2次，加入100TCID50的病毒液，37°C孵育2h，弃上清，PBS洗2次，加入维持液，设空白对照组和病毒对照组，转入培养箱中37°C培养至72h，期间观察细胞病变，最终测定药物处理组和病毒对照组PRRSV载量的变化。

后处理是为了测定药物对病毒增殖的抑制作用，将MARC-145细胞接种于96孔板，长至80%～90%，弃培养液并用PBS洗2次。加入100 TCID₅₀的病毒液，37°C孵育2h，弃上清，PBS洗2次，加入不同稀释倍数的脂来安处理2-6h，设空白对照组和病毒对照组，转入培养箱中37°C培养至48h，测定脂来安处理组和病毒对照组PRRSV载量的变化。

3 结果

3.1最大无毒浓度测定

采用倍比稀释法和CCK8试剂盒测定脂来安对Vero细胞的活性影响以确定最大无毒浓度。结果如图2所示，当脂来安的浓度为0.1×（1/2）⁹时，细胞的存活率和对照差异不显著，但是细胞在这个浓度下的形态发生改变。因此脂来安对Vero细胞的安全浓度应该小于0.1×（1/2）⁹，对应稀释倍数为5120倍。

采用倍比稀释法和CCK8试剂盒测定脂来安对Marc-145细胞的活性影响以确定最大无毒浓度。结果如图3所示，当脂来安的稀释倍数为1280时，细胞的存活率和对照差异不显著，但是细胞在这个浓度下的形态发生改变。因此脂来安对Marc-145细胞的安全浓度稀释倍数应该大于1280倍。

图 2 Vero在不同浓度的样品下的细胞存活率，∗∗∗; P<0.001; ∗∗; P< 0.01; ∗; P<0.05。

图 3 Marc-145在不同浓度的样品下的细胞存活率，∗∗∗P<0.001; ∗∗ P< 0.01; ∗P<0.05。

3.2 体外抗PRRSV结果

3.2.1 共处理实验结果

当脂来安的稀释倍数在1280～2560之间时，处理组病毒拷贝数与病毒对照组差异显著，表明在这个浓度范围内，病毒显著受到脂来安的抑制，脂来安对PRRSV有一定的直接杀灭作用，但不能完全杀灭病毒。稀释倍数为1280时，病毒载量约为10^3.08copies/μL，稀释倍数为2560时，病毒载量为10^4.06copies/μL；病毒对照的载量为10^8.56copies/μL。

图4.共处理试验结果，不同稀释倍数的脂来安作用下PRRSV拷贝量的变化，∗∗∗ P<0.001; ∗∗ P< 0.01。

图5.共处理效果，A：细胞对照，B：病毒对照， C ：1300倍稀释脂来安处理，D：1600倍稀释脂来安处理，E：1800倍脂来安稀释处理。放大倍数40´。

3.2.2 预处理试验结果

将不同浓度的脂来安处理Marc-145细胞2h，弃液，加入100倍TCID₅₀的PRRSV病毒液孵育1h后弃液，重新加入维持液培养至72h。

根据病毒载量的变化，预处理作用效果与病毒对照差异不显著。脂来安无法阻断PRRSV对Marc-145细胞的感染。

图6.预处理试验结果，不同稀释倍数的脂来安作用下PRRSV拷贝量的变化，ns表示差异不显著。

图7. 预处理试验中细胞病变情况，A：细胞对照，B：病毒对照， C ：1300倍稀释脂来安处理，D：1600倍稀释脂来安处理，E：1800倍脂来安稀释处理。

3.2.3 后处理试验结果

后处理试验发现，脂来安的稀释倍数在1280～2560之间时对PRRSV的增殖有一定的抑制作用。稀释倍数为1280时，病毒载量约为10^5.27copies/μL，稀释倍数为2560时，病毒载量为10^8.2copies/μL；病毒对照的载量为10^8.94copies/μL。

图8.后处理试验结果，不同稀释倍数的脂来安作用下PRRSV拷贝量的变化，∗∗ P<0.01; ∗P< 0.05。

图9.后处理试验中细胞的病变情况，A：细胞对照，B：病毒对照， C ：1300倍稀释脂来安处理，D：1600倍稀释脂来安处理，E：1800倍脂来安稀释处理。

3.3 体外抗PEDV 结果

如图10A所示，在特定浓度范围内，脂来安溶液对PEDV感染的Vero细胞表现出显著保护作用。其中，0.1×(1/2)¹⁰（稀释10240倍）和0.1×(1/2)¹¹（稀释20480倍）浓度组的细胞存活率较病毒对照组显著提高（p<0.05），且0.1×(1/2)¹⁰（稀释10240倍）浓度组的保护效果最为显著。

通过qPCR检测PEDV病毒载量（图10B），结果显示，脂来安稀释10240倍、20480倍及40960倍浓度组的病毒RNA拷贝数均显著低于病毒对照组（p<0.05），其中稀释10240倍浓度组的病毒抑制效果最为明显，与细胞活性实验结果一致。

图10. 脂来安体外抗PEDV结果。A：各组细胞存活率；B：各组PEDV相对表达量；C：0.1×（1/2）⁹实验组细胞状态；D：0.1×（1/2）¹⁰实验组细胞状态；E：0.1×（1/2）¹¹实验组细胞状态；F：0.1×（1/2）¹²实验组细胞状态；G：病毒对照组细胞状态；H：空白对照组细胞状态，∗∗∗P<0.001; ∗∗ P< 0.01; ∗ P<0.05。

4 结论

（1）实验结果表明，脂来安的稀释倍数在1280-2560之间对PRRSV具有直接杀灭作用和抑制病毒增殖的作用，但是脂来安在细胞的安全浓度内，无法阻断PRRSV对细胞的感染。

（2）实验结果表面，脂来安在特定浓度范围内可显著抑制PEDV对Vero细胞的感染，并提高细胞存活率。其中，稀释20480倍表现出最优的保护效果，同时该浓度组的PEDV病毒载量（qPCR检测）亦显著降低，表明脂来安可能通过抑制病毒复制发挥抗PEDV作用。